CRISPR-на-чіпі може стати інструментом для діагностики раку

CRISPR, дитя сучасної біології, росте не по днях, а по годинах. Він виріс з незрозумілою частини бактеріальної захисної імунної системи в інструмент для лікування генетичних захворювань, поліпшення мікроорганізмів, поліпшення виробництва їжі і знищення шкідників. З тих пір, як вчені взяли на озброєння цей інструмент для редагування генів і почали використовувати його на клітинах ссавців, CRISPR був забарикадований за клітинними мембранами. Технологія редагування генів творить свою магію, відсікаючи шматочки пошкодженої ДНК і вставляючи здорову заміну. Всі ці дії з вирізання і вставлення сегментів проходили в живих клітинах. До цих пір.

минулого тижня в журналі CRISPR Journal було опубліковано дослідження, нарешті звільнене CRISPR від його клітинної в'язниці. Замінивши компоненту «ножиць» CRISPR альтернативною версією, вчені з Інституту редагування генів в Делавері розробили нову систему CRISPR, яка може різати вільно плаваючу ДНК в пробірці.

Для допомоги у проведенні реакцій заповнюється пробірка клітинними екстрактами: набором ферментів та інших біомолекул, необхідних для роботи CRISPR.

У чому ж прорив?

Діагностичне диво

Змусити CRISPR працювати за межами клітини може здатися дивною академічної завданням, але при розробці системи вчені тримали в розумі дві певні цілі.

По-перше, цей інструмент дозволяє вченим одночасно робити кілька генетичних врізок, в той час як попередні версії були обмежені редагуванням ДНК в межах одного гена. Це чудові новини для персоналізованої медицини, особливо діагностики раку; багато видів раку мають мутації в декількох місцях, які відповідають на різне лікування по-різному.

Перед початком лікування лікарі часто відправляють біопсійний зразок пухлини пацієнта на секвенування ДНК. Цей важливий крок допомагає виявити безліч генетичних мутацій, які призводять до зростання або поширенню конкретної пухлини.

З допомогою нового інструменту учені можуть точно імітувати ці мутації в синтетичних фрагментах ДНК в пробірці, по суті відтворюючи рак в безпечної, контрольованому середовищі. Це дає вченим доступ до біологічних шляхами, порушених мутаціями, і може допомогти в створенні персоналізованої стратегії лікування.

Що ще більш вражає, такого роду діагностику можна провести всього за один день. «Це особливо важливо для діагностики, пов'язаної з раком, коли рахунок йде на хвилини або годинник», говорить автор дослідження доктор Ерік Кмиец.

Кмиец не першим побачив у CRISPR інструмент діагностики. Про те, що крім генної терапії CRISPR може потужно показати себе в діагностиці, було зрозуміло давно. Раніше ми писали про те, що дві групи вчених , які ефективно полюють на віруси Зіку, денге або небезпечні штами ВПЛ, які призводять до раку шийки матки.

Кмиец стверджує, що його винахід вимагає значно менше часу, щоб підтвердити рак поза тіла, в основному із-за здатності вносити кілька редакцій одночасно.

Усвідомивши потенціал і рентабельність CRISPR як діагностичного інструменту, Кмиец і його колеги вже шукають комерційного партнера для розробки технологи «CRISPR-на-чіпі» для діагностики раку.

Якщо відкласти в сторону безпосередні програми, команда вчених також сподівається розширити терапевтичні можливості CRISPR до більш широкого набору захворювань людини. Існуючі інструменти CRISPR ідеально підходять для лікування хвороб, які викликані мутаціями в одному гені, таких як серповидно-клітинна анемія або хвороба Хантінгтона. Але оскільки робота Кмиеца націлена на кілька генів одночасно, вона може потенційно призвести до лікування хвороб з більш складним генетичним походженням — множинних мутацій у безлічі генів — якщо ці мутації добре охарактеризовані.

Крізь лінзу

Ізоляція CRISPR в пробірці має й інший плюс: вона дозволяє вченим чітко зрозуміти, що відбувається до, під час і після редагування. І оскільки клінічні випробування CRISPR активно просуваються, важливо розуміти, як зробити технологію більш точної і ефективною.

CRISPR уже багато чого досяг, але незручна правда полягає в тому, що вчені поки не зовсім впевнені, як інструмент працює, потрапляючи в клітину. Як інструменти взаємодіють з іншими біокомпонентами в клітці? Він відсікає тільки цільову ДНК або ж його ножиці можуть піти в рознос в певних обставинах?

«Коли ви працюєте з CRISPR всередині клітини, ви працюєте в чорному ящику, в якому не можете спостерігати за механізмами, які роблять ці приголомшливі речі», говорить Кмиец. «Ви можете бачити результати, тобто зміни генів, але як ви до цього прийшли — не обов'язково, а це важливо для того, щоб переконатися в безпеці CRISPR для лікування пацієнтів».

Обмежуючи CRISPR серією біохімічних реакцій в тестовій пробірці, вчені пропонують спосіб розглянути складні молекулярні взаємодії, які проходять під час розрізу ДНК, заміни генів та інших процесів. Підхід — виключно редукционистский. Але він дозволяє безклітинній системі працювати подібно Arduino, експериментувати з можливостями CRISPR і створювати нові біологічні інструменти, які й уявити важко.

Підміна

Інститут редагування генів практично відразу зіткнувся з проблемою, розробляючи свою бесклеточную систему.

Проблемною дитиною опинився Cas9, ножичний білок, який використовується в системах CRISPR. Коли вчені замішанійого з плазмідною ДНК — типом циркулярної ДНК, яку вчені часто використовують для доставки генів у клітини — в пробірці, білок був абсолютно недоступний.

З'ясувалося, що Cas9 потрібно замінити на Cpf1 (він же Cas12a), інший член зростаючої бібліотеки Cas-білків. Вперше відкритий в 2015 році, Cpf1 вже довів свою користь у створенні трансгенних мишей і коригування мутації, що викликає м'язову дистрофію. Не так давно Cpf1 використовувався в системі DETECTR для боротьби з вірусами, що викликають рак. У цього білка світле майбутнє: компанія Editas, редактирующая гени, ліцензувала його для подальшої розробки в 2016 році.

Обмін спрацював. Система CRISPR-Cpf1 прийшла в дію в тестовій пробірці. В ході кількох експериментів вчені довели, що вільна від клітини система може повторити більшість редакцій, які CRISPR вносить всередині клітини. Що примітно, ножиці спрацювали трохи не так, як у Cas9. Коли Cas9 робить розріз, він залишає сверхгладкие «обрубане кінці» на розрізаною ДНК. Це ускладнює введення нових шматочків генетичного матеріалу. Оскільки кінці дуже гладкі, інструментарій вимагає точного вирівнювання документа блоку ДНК, щоб він ковзнув на місце.

І навпаки, Cpf1 залишає «липкі» кінці. Ці шматочки ДНК виступають як плечі, немов скотч підтримують захоплення замінює ДНК. Можливо, саме тому Cpf1 працює краще, ніж Cas9, в пробірці, але це ще треба перевірити.

Система Кмиеца — лише один із прикладів того, як далеко просунувся CRISPR. Оскільки CRISPR продовжує зростати, його розробники обіцяють нам багато нового, чого ми навіть і уявити не можемо.